میکروبیولوژی

(PCR (Polymerase Chain Reaction

تکنیکی است که به طور گسترده ای در بیولوژی مولکولی به کار برده می شود. این تکنیک نام خود را از یکی از ترکیبات کلیدی خود، DNA پلیمراز ، که جهت تهیه تعداد بسیار زیادی از کپی از یک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته می شود؛ می گیرد. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. که محصول نهایی PCR را به طور کلی Amplicon می گویند. که همان ماده تقویت شده است. امروزه روش ‏PCR‏ جايگاه بسيار مهمي را در جنبه‌هاي مختلف مهندسي ژنتيك، بيولوژي مولكولي، ميكروب‌شناسي تشخيصي، تشخيص سرطان و بيماري‌هاي ژنتيك، تشخيص هويت، جرم شناسي (پزشكي قانوني جهت تشخيص منشأ نمونه اسپرم، خون) وتعيين ترادف، باستان‌شناسي، مطالعات تكاملي موجودات و ... پيدا كرده است.

 تاریخچه:

 این تکنیک در سال 1984 توسط   K. Mullis معرفی شده و بطور سریعی در اکثر آزمایشگاههای جهان جهت اهداف مختلف بکار گرفته می شود.

که برخی از آنها عبارتند از: کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)، فیلوژنی بر پایه DNA، بررسی های عملکردی ژنها، تشخیص های ارثی ، شناسایی و انگشت نگاری ژنتیکی و ردیابی و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال 1993 مولیس بخاطر ابداع این روش، جایزه نوبل را دریافت نمود.

بطور کلی مراحل PCR به صورت زیر است:

1-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد به درمای حدود 96-94 (یا 98 درجه زمانی که از پلیمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده می شود) است که معمولا 9-1 دقیقه بطول می انجامد. البته این مرحله در مواردی بکار می رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.

2-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله معمول PCR  بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان 98-94 درجه به مدت 30-20 ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم DNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA و تولید DNAتک رشته ای است.

3-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله درمای واکنش به 65-50 درجه به مدت 40-20 ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNAالگو که حالا تک رشته ای است فراهم آورد. بطور تیپیک درجه حرارت اتصل حدود 5-3 درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرایمر انتخاب می شود. مناسب ترین اتصال DNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد می گردد که هر دورشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسب تر باشد این اتصال قوی تر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است. (نرم افزار  blast برای طراحی پرایمر استفاده می شود).

4-   مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taqپلیمراز در درجه حرارت 80-75 درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته  ولی بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده می شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از 5’-3’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می کند.  مدت زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم پلیمراز بایستی 1000 نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر می شود.

5-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای 74-70 درجه بمدت 15-5 دقیقه صورت میگیرد جهت اطمینان از تبدیل کلیه DNAهای تک رشته ای به دورشته ای انجام می گیرد.

6-   مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در 15-4 درجه سانتیگراد جهت نگه داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می گیرد.

 جهت اطمینان از اینکه محصول PCR همان توالی مد نظر بوده از الکتروفورز برروی ژل استفاده می شود. در این روش جهت مشخص کردن قطعه DNA با وزن مولکولی مشخص و مورد نظر از DNA Ladder استفاده می شود و قطعه مورد نظر در الکتروفورز از روی اندازه مولکولی استاندارد و کنترل مثبت مشخص می گردد. در روش Real-Time PCR  نیاز به الکتروفروز بعد PCR نیست.

انواع تکنیکهای PCR:

این تکنیکها از طریق ایجاد تغییرات مختصری در تکنیک PCR اولیه برای مثال ایجاد تغییرات در نحوه بکارگیری پرایمرها و... ایجاد و ابداع شده و جهت اهداف خاصی برنامه ریزی و اختصاصی شده اند .

1-      Allele-specific PCR

2-      Assembly PCR یا PCA (Polymerase Cycling) Assembly

3-      PCR نامتقارن (Asymetric PCR)

4-      Helicase - Dependent amplification 

5-      Hot-start PCR

6-      Inter sequence  specific PCR ISSR 

7-      Inverse PCR

8-      Ligation-mediated PCR

9-      (Methylation - specific PCR (MSP

10-    MiniPrimer PCR

11-     Multiplex PCR   

12-    Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification MLPA

13-    Nasted PCR

14-    Overlap Extension PCR

15-    ( Quantitative PCR (Q-PCR

16-    Reverse Transcription PCR

17-    Solid Phase PCR 

18-    ( Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR

19-    PAN-AC

20-    Touch Down PCR

21-    Universal Fast Walking

22-    RFLP-PCR(PBR) 

23-    SSCP-PCR               

24-    SOEING 

 25-  RAPD-PCR یاArbitraily  primed - PCR

 26-   ARMS- PCR

27-    Real-Time-PCR                    

28-    BOOSTER-PCR            

29-    DAF-PCR  

30-    SCAR-PCR          

31-     AFLP    

32 -ALP,ST          

 (‏Multiplex- PCR‏)‏: يكي از روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ است كه در آن تنها يك جايگاه ژني مورد بررسي قرار مي‌گيرد، با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد: ‏

1-  بخش‌هاي بزرگي از يك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. براي مثال كشف نقص‌ها در بيماري ديستروفي عضلاني روشن يا كشف بخش‌هاي مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مايكروباكتريوم توبر كلوزيس عامل بيماري سل، ‏

‏2-  بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود.‏

‏3-  مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.‏

 (‏RT- PCR‏)‏: اين روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن ‏RNA‏ است. اولين مرحله در اين روش تبديل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏ DNAاي كه مكمل توايس‌هاي ‏mRNA‏ است) توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس می باشد (RT). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضي از ويروس‌ها مانند ويروس هپاتيت ‏B‏ هرگز به شكل ‏DNA‏ مابين در اثر آنزيم نسخه‌بردار معكوس درنمي‌آيد. آنزيم نسخه‌بردار معكوس (‏RT‏) در اين روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.

كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك ‏DNA‏ پليمر از مقاوم به نام )‏Tth‏( بهبود يافت كه در حضور يون ‏Mn+2‎‏ داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته مي‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي )‏EGTA‏) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از ‏DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.‏

 (‏ARMS- PCR‏)‏ : اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است. اين روش نام‌هاي ديگري نيز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

 ‏Nested- PCR‏: در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود، طوري كه جفت دوم در بین جفت اول جاي مي‌گيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير مي‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف كوچكتري از ‏DNA‏ كه درون ‏PCR‏ اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير مي‌شود.‏

مزاياي اين روش تغيير يافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1- نياز به پروب (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است، 2- حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است 3- به دليل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بيماري‌هاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.‏

همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه مي‌تواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكان‌پذير است. جنين‌هاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.

‏Real-Time PCR‏: به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را مي‌دهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از كاوشگرها يا پروب‌هاي هيبريداسيون نشان‌دار شده با رنگ‌هاي فلورسانس در انتهاي 5 يا 3 استفاده مي‌شود. كه امكان پايش پيوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازي آنها در روش‌هاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد مي‌دهد. اين سيستم در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلك‌هاي ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روش‌هاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم ‏PCR‏ معمولي شده است. سازندگان و كاربران اين روش سعي مي‌كنند محصول ‏PCR‏ كوچك‌تر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهينه نمي‌كند. البته اين روش داراي معايبي نيز است از جمله مي‌توان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرم‌ها با شيمي برخي رنگ‌هاي فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروس‌هاي عامل بيماري‌هاي انسان از اين روش استفاده شده است.

 ‏

Touch down PCR :  در اين روش دماي آنيلينگ ازدماي بالاتر از Tm  بندرت كاهش مي یابد وموجب كاهش  محصول كاذب و پرايمر دايمر مي شود.

Long distance PCR  : با اين روش قطعات ببيش از 20 kb همانند سازي ميشوند. براي انجام اين نوع PCR بايد DNA  ژنومي از كيفيت بالايي برخوردار باشدو پرايمر ها  به دقت طراحي شوند. براي اينكاراز klon taq استفاده ميشود.اين آنزيم نسخه اي از DNA poly  است كه قسمت N ترمينال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط ميشود و فاقد 5` اگزو نوكلئازي است.

Hot start PCR  : عبارت است از جدا كردن يك يا چند تركيب مهم PCR  ( ترجيحا" انزيم پليمراز) بطوريكه بلا فاصله بعد ار دناتوراسيون DNA هدف به واكنش اضافه ميشوند  ( استفاده از , PCR gem  و آنتي بادي آنزيم پليمراز )

- Hot start  به كمك آنتي بادي : مونوكلونال آنتي بادي ضد آنزيم پليمراز را به واكنش اضافه ميكنند درنتيجه  فعاليت پليمرازي آنزيم را مهار ميكند. هنگاميكه دماي واكنش به 94 درجه مي رسد آتي بادي دناتوره مي شود و دو باره  پليمراز فعال مي شود.

 - Hot start  به كمك Ampliwax : به ديواره لوله هاي محصوص اينكاربه نوعي واكس آغشته است كه بعد از مختصري گرم كردن ذوب شده و روي ئاكنش را ميپوشاند .  آنزيم پليمراز را روي واكس قرار ميدهند . در دماي 94 درجه اين واكس بخار ميشود و آنزيم پليمراز با واكنش تماس پيدا مي كند.

PCR  با پرايمر هاي احتمالي   (Degeneracy  primer):

 اين پرايمر ها بر اساس اطلاعات ترادف پروتئين يك ژن طراحي ميشوند و بر اساس اسيد هاي آمينه اي انجام ميگيرد كه داراي يك يا دو كدون باشند. پرايمر هايRAPD    - بنام پرايمر هاي اختياري هم گفته ميشوند . اين پرايمر ها پلي مرفيسم را بدون شناخت توالي نوكلئوتيدي رديابي مي كنند .

 RFLP-PCR : در این روش ابتدا قطعه حاوی جایگاه چند شکلی را با واکنش زنجیره پلی مراز و استفاده از دو پرایمر مخصوص که به همین منظور طراحی شده تکثیر می نمایند و پس از هضم آنزیمی ، الکتروفورز می کنند . در PBR جهش هایی از نوع نقطه ای و حذف و اضافه که باعث تغییر در سطح قطعه آنزیمی می گردند قابل تشخیص است . در PBR تنوع در داخل منطقه ای که از دو طرف به پرایمر ختم شده تعیین می نمود که این ناحیه معمولا kb 5/0 است . ضمنا در PBR مزایایی چون سادگی ؛ سرعت زیاد ، عدم نیاز به مواد رادیواکتیو و تکرارپذیری بالا مطرح می باشد .

SSCP-PCR :زمانیکه DNA دو رشته ای در روی ژل الکتروفورز حرکت داده می شود ، حرکت DNA به اندازه قطعه بستگی دارد به طوریکه مولکولهای کوچک از منافذ ژل به آسانی عبور می کنند . در الکتروفورز SSCP ابتدا از یک ماده دناتوره کننده مانند اوره برای تبدیل DNA ود رشته ای به تک رشته ای استفاده می شود . در هنگام راندن DNA تک رشته در ژل اثر متقابل داخل مولکولی روی می دهد به عبارت دیگر DNA تک رشته قادر است در بخش هایی یا خود باند تشکیل دهد بنابراین حرکت مولکولها در این حالت بیشتر به ساختار مولکول DNA تک رشته نیز وابسته است ( ساختمان سرم )

ساختمان سوم در قطعه تک رشته وابسته به توالی کل قطعه است اگر جهش در توالی DNA رخ دهد ساختار قطعه تغییر می یابد و سرعت حرکت آن متفاوت از نوع وحشی است ، بنابراین قابل شناسایی است .

اگر پلی مورفیسم در قسم آغازین محصول PCR باشد شناسایی آن با SSCP بسیار راحت تر است .

DGGE- PCR: یکی از روش های مناسب برای آشکار سازی جهش ها است . این روس بر روی فرآورده های PCR صورت می گیرد در صورتیکه قطعات رشته DNA در یک نوکلئوتید با هم متفاوت باشند ، الگوی واسرتست شده متفاوتی را نشان می دهند . در این روش دو نمونه DNA دردو ستون جداگانه از یک ژل پل اکریلامید که دارای نسبتی از غلظت ماده و اسرتست کننده ( معمولا فرمامید ) است مورلاالکتروفورز قرار می گیرد . وقتی مولکولها به سطح بخرانی دناتوره می رسند دو رشته DNA شروع به جدا شدن می کنند . در این حالت کاهش معنی داری در حرکت قطعات ایجاد می شود . این نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل می کند و باعث تاخیر در حرکت مولکلول DNA جهش یافته نسبت به فرم وحشی می گردد.

DGGE به موارد رادیواکتیو و مواد  شیمیایی سمی احتیاج ندارد ولی ابزار پیشرفته می خواهد . درصد تعیین موتاسوین در این روش خیلی نزدیک به 100 % است . نوع مقابله ای از این روش TGGE می باشد که در آن از حرارت به جای غلظت مواد شیمیایی در ژل استفاده می شود . بهترین طول قطعات برای DGGE بین bp 1500-150 می باشد . برای واسرتست شدن کامل قطعات حاصل از زنجیره پلی مراز از یک ناحیه بالاترین دمای ذوب مصنوعی GC-clamp استفاده می شود.

 Guven.S,Yilmaz. E,kutby.H and eta. The Diagnostic Value of Polymerase chain Reaction (PCR) in Bronchialveolveolar Lavage. Eastern Journal of Medicine 9(1): 07-12, 2004

 Maeda.S and etal. Helicobacter Pylori specific nested PCR assay for the detection of 23 S rRNA mutation associated with clarithomycin resistance. Gut.bmj.com.2007

 Pusterla.N and etal. Real time polymerase chain Teaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for equine Infectious Disease. Journal vet International Medical; 20:3-12, 2006.

 Salto‎-Telez M,etal. Multiplex RT-PCR for the Detection of Leukemia-Associated Translations. Journal of Molecular Diagnostic; 54):231-236, 2003.‎